Spektrofluorymetryczne Oznaczanie Substancji

Spektrofluorymetryczna metoda oznaczania substancji wykorzystuje elektronowe przejścia energetyczne zachodzące w atomach lub cząsteczkach spowodowane absorpcją, a następnie emisją promieniowania elektromagnetycznego. Jeśli układ elementarny (atom lub cząsteczka) pochłania energię w postaci promieniowania elektromagnetycznego, wówczas przechodzi ze stanu elektronowego o najniższej energii (zwanego podstawowym) w jeden z możliwych elektronowych stanów wzbudzonych. Po absorpcji promieniowania układ może zużyć nadmiar energii w wyniku reakcji chemicznej lub powrócic do stanu podstawowego oddając energię w zderzeniach z innymi atomami lub cząsteczkami (tzw. przejścia bezpromieniste), albo przez emisję promieniowania elektromagnetycznego (przejścia promieniste). Emisja promieniowania elektromagnetycznego w wyniku przejść pomiędzy stanami elektronowymi o tej samej multipletowości (np. S1 Ž S0) nosi nazwę fluorescencji.

Nie wszystkie substancje mają zdolność emisji fluorescencji. Fluorescencję cząsteczkową wykazują zazwyczaj związki aromatyczne o budowie planarnej, zawierające sprzężone układy wiązań podwójnych oraz niektóre ich kompleksy z metalami. Uproszczony schemat przejść elektronowych w cząsteczce odpowiadających fluorescencji przedstawiono na rysunku.
 

 
Natężenie promieniowania fluorescencyjnego, I_f, jest wprost proporcjonalne do ilości promieniowania zaabsorbowanego przez próbkę oraz do wydajności kwantowej fluorescencji W:
I_f = p(I₀ -I)W, (1)
gdzie:
p – oznacza współczynnik proporcjonalności
I₀ – natężenie promieniowania wzbudzającego (padającego)
I – natężenie promieniowania po przejściu przez roztwór.

Zgodnie z prawem Lamberta – Beera:
I = I₀10^-alc, (2)
gdzie:
a – oznacza współczynnik absorpcji
l – grubość kuwety
c – stężenie analitu.

Wydajność kwantowa fluorescencji zależy od stężenia substancji fluoryzującej następująco:
W = W₀e^{-k (c-c₀)} , (3)
gdzie:
c₀ – oznacza wielkość progowego stężenia, przy którym zaczyna zachodzić stężeniowe wygaszanie fluorescencji
k – współczynnik wygaszania stężeniowego
W₀ – wydajność fluorescencji przy progowym stężeniu substancji fluoryzującej c = c₀ (wartości c₀ i k zależą od rodzaju substancji fluoryzującej i rozpuszczalnika).

Stąd:
I_f = pI₀ (1-10^-alc) W₀e^{-k (c-c₀)} , (4)

Jeżeli stężenie substancji fluoryzującej jest dostatecznie małe (c ‹‹ c₀, alc ‹ 0,01), to po rozwinięciu funkcji wykładniczych 10^-alc oraz W₀e^{-k (c – c₀)} w szereg Taylora otrzymujemy:
10^-alc ››~1-2,303alc
W = W₀e^{-k (c-c₀)}e^{-k (c – c₀)} = W₀e^(kc₀) (1-kc) ~ W₀e^(kc₀), (kc ‹‹ 1).

Zatem, przy powyższych założeniach wydajność kwantowa fluorescencji jest wielkością stałą, a wyrażenie na I_f przyjmuje następującą postać:
I_f = 2,303pI₀W’alc= KI₀lc (5)
gdzie:
W’ = W₀e^(kc₀) ,
K = 2,303pW’a jest współczynnikiem proporcjonalności.

Dla stałej wartości I₀ natężenie fluorescencji jest więc wprost proporcjonalne do stężenia substancji oznaczanej. Zależność ta jest zachowana dla roztworów silnie rozcieńczonych, o stężeniu do kilku ppm. W przypadku bardziej stężonych roztworów wartość wyrażenia 10^-alc jest mała i dla stałej wartości I₀ natężenie fluorescencji maleje w wyniku wygaszania stężeniowego (patrz wzór 4 dla 10^-alc ‹‹ 1):
I_f = pI₀W₀e^{-k (c-c₀)} , (6)
Przykładową zależność natężenia fluorescencji od stężenia ryboflawiny przedstawiono na poniższym rysunku.

Widać z niego wyraźnie, że zależność fluorescencji od stężenia w szerokim jego przedziale nie jest prostoliniowa. W analizie chemicznej wykorzystuje się prostoliniowy fragment zależności natężenia fluorescencji od stężenia analitu, zgodnie z wzorem (5).

Przy oznaczeniach spektrofluorymetrycznych należy brać również pod uwagę zjawisko absorbcji promieniowania fluorescencyjnego spowodowane obecnością w roztworze substancji towarzyszących, mających zdolność fluorescencji lub wygaszania fluorescencji, co jest potencjalnym źródłem błędów. Istotny wpływ na natężenie promieniowania fluorescencyjnego ma także temperatura (ze wzrostem której fluorescencja maleje), rodzaj rozpuszczalnika i pH roztworu.

Główną zaletą metod fluorymetrycznych jest ich duża czułość, znacznie przewyższająca czułość metod spektrofotometrii absorbcyjnej. Metodami flourymetrycznymi można oznaczać substancje organiczne i nieorganiczne o stężeniach od dziesiętnych części ppb do kilku ppm (np. istnieje metoda oznaczania magnezu w zakresie stężeń 0,02 – 0,2 ppb). Metody te charakteryzują się dobrą precyzją i dokładnością, są bardziej selektywne niż metody absorbcjometryczne, ponieważ dają większą możliwość selekcji warunków oznaczenia przez dobór odpowiedniej długości fali promieniowania wzbudzającego i mierzonego wtórnego promieniowania fluorescencji oraz pH roztworu.